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Lowry–Folin法測定液體樣品中蛋白質含量

   日期:2013-09-23     來源:實驗室資訊網    瀏覽:39160    
 一、 實驗目的
1、 了解測定蛋白質的常用方法
2、 掌握蛋白質含量測定的經典Lowry – Folin法。
二、 實驗原理
在堿性溶液中,蛋白質中的肽鍵與銅鹽可產生雙縮脲反應,產生絡合物,此絡合物會將磷鉬酸-磷鎢酸試劑還原,產生深藍色復合物。在一定的條件下,藍色深淺與蛋白質的量成正比。在波長540nm處測定樣品的吸光度,與標準曲線對比,可確定其蛋白質含量。這種方法是檢測可溶性蛋白質含量最靈敏的經典方法之一。
三、 實驗步驟
1、 標準曲線的繪制
(1) 取10ml具塞試管6支,編號,分別準確吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml血清蛋白溶液置于相應的試管中,在各試管中分別加入1.00、0.80、0.60、0.40、0.20和0.00ml的蒸餾水,使總體積達到1.00ml。不同濃度BSA 溶液的配置
編號 0(空白) 1 2 3 4 5
BSA (ml) 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
水(ml) 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0
BSA 質量(µg) 0 40 80 120 160 200
(2) 取試劑A15.00ml,試劑B0.75ml和試劑C0.75ml,在50ml三角瓶中混勻,在每只試管中分別準確加入此試劑1.00ml,充分搖勻,靜置15min.
(3) 分別在各試管中準確加入Folin-酚試劑稀釋液3.00ml,立刻震蕩,充分搖勻。
(4) 靜置30min,在540nm波長下測定每個試管中溶液的吸光度(A值)。
(5) 以A值為縱坐標,BSA 質量(即0~200µg)為橫坐標,繪制標準曲線,求出回歸方程和相關系數R2。
2、 樣品的測定
將啤酒樣品適當稀釋(20倍),吸取2份,各1.00ml,重復步驟1中的(2)~(4)。
四、 實驗試劑
1、 試劑A:稱取Na2CO3100.0g溶于1000ml(最終體積)0.5mol/LNaOH中。
2、 試劑B:稱取CuSO4·5H2O1.0g溶于100ml(最終體積)蒸餾水中。
3、 試劑C:稱取酒石酸鉀鈉2.0g溶于100ml(最終體積)蒸餾水中。
4、 牛血清蛋白 (BSA)標準溶液:準確稱取牛血清蛋白,配制成濃度為200µg/ml的溶液。
5、 2mol/LFolin-酚試劑。
五、 實驗數據與處理
分組 0(空白) 1 2 3 4 5 樣品1 樣品2
吸光度 0.000 0.073 0.157 0.216 0.273 0.341 0.172 0.164
樣品中蛋白質的含量(µg/ml) = XA Ⅹ N Ⅹ 0.001
式中,XA——根據標準曲線計算出來的蛋白質量(對應稀釋樣品中的蛋白質濃度,µg/ml) N——樣品的稀釋度數(N=20)
計算:標準曲線 y = 0.0017x + 0.0078(R2=0.9957)
當y1=0.172時,代入得x1=96.59(µg/ml)樣品1中蛋白質含量m1=1.93mg/ml
當y1=0.172時,代入得x1=96.59(µg/ml)樣品1中蛋白質含量m1=1.93mg/ml
當y2=0.164時,代入得x2=91.88(µg/ml)樣品2中蛋白質含量m2=1.84mg/ml
平均含量:(1.93+1.84)/2=1.885 mg/ml
平均偏差:(1.93-1.84)/2 = 0.045
相對平均偏差:0.045/1.885 Ⅹ 100% = 2.39%
六、 實驗注意事項
1、 加入Folin-酚試劑后立即將反應液搖勻,以便Folin-酚試劑在堿性溶液中破壞之前即能被銅-蛋白質復合物還原。
2、 短時間內反應液的顏色保持穩定,因此,靜置30min后應立即測定吸光度,若拖延時間過長,顏色將會變化,影響測定結果。
七、 思考題
1、 測定食品中蛋白質含量的常用方法有哪些?其原理、適用性如何?
答:①凱氏定氮法
原理:樣品與濃硫酸共熱,含氮有機物即分解產生氮(消化),氮又與硫酸作用,變成硫酸氫。經強堿堿化使之分解放出氫氣,借蒸汽將氨蒸至酸液中,根據此酸液被中和的程度可計算得樣品的氮含量,再乘以6.25,即得樣品中蛋白質含量,以甘氨酸為例,反應式為:
NH2CH2COOH + 3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3
2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4
(NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+NaSO4+2NH3
適用性:用于標準蛋白質含量的準確測定,干擾少,費事太長;靈敏度低,適用于0.2~1.0mg氮,誤差為±2%。
②雙縮脲法
原理:在強堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物,稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或連個直接連接的肽鍵,或能過一個中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測量蛋白質含量。
適用性:用于快速測定,但不太靈敏;不同蛋白質顯色相似;誤差范圍為1~10µg蛋白質
③Folin-酚試劑法
原理:在堿性溶液中,蛋白質中的肽鍵與銅鹽可產生雙縮脲反應,產生絡合物。此絡合物會將磷鉬酸-磷鎢酸試劑還原,產生深藍色復合物。在一定的條件下,藍色深淺與蛋白質的量成正比。在波長540nm處測定樣品的吸光度,與標準曲線對比,可確定其蛋白質含量。
適用性:耗時長,操作要嚴格計時;顏色深淺隨不同蛋白質變化,靈敏度高;最低位0~5µg;通常測定范圍是20~250µg;也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。
④紫外吸收法
原理:蛋白質分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵,使蛋白質具有紫外吸收的性質,吸收峰在280nm處,其吸光度與蛋白質含量成正比。此外,蛋白質溶液在280nm時的吸光度值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下,蛋白質溶液的吸光度值與蛋白質濃度的正比關系,可進行蛋白質含量的測定。
適用性:用于層析注流出液的檢測;較為靈敏50~100µg;適用于與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。
⑤考馬斯亮藍法
原理:考馬斯亮藍G-250染料,在酸性溶液中與蛋白質結合,使燃料的最大吸收峰位置λmax,由465nm變為595nm,溶液的顏色也由棕黑色變為藍色,在595nm下測定的吸光度值,與蛋白質濃度成正比。
適用性:干擾物質少,顏色穩定,顏色深淺隨不同蛋白質變化;靈敏度最高為1~5µg。
2、 使用分光光度計時應注意哪些問題?
答:分光光度計特點:準確度高,測量范圍廣,在一定條件下可同時測定水樣中兩種或兩種以上的物質組成含量。
注意:①使用前,仔細閱讀其使用說明書;②若大幅度改變測試波長,需稍等片刻,等燈熱平衡后,重新調零及滿度后,再測量;③指針式儀器在未接通電源時,電表的指針必須位于零刻度,若不是,則需進行機械調零;④操作人員不宜輕易觸動燈泡及反光鏡燈,以免影響光效率;⑤放大其靈敏度換擋后,必須重新調零;⑥比色皿使用時需注意方向性,并應配套使用,以延長其使用壽命,使用完畢后,應立即用蒸餾水沖洗干凈,并用干凈柔軟的紗布擦水跡,以防表面光潔度被破壞。
 
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